Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс icon

Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс



НазваниеБиологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс
Дата конвертации10.08.2012
Размер129,77 Kb.
ТипРеферат
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс.


Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс.Содержание1. Введение 1. История вопроса 2. Перспективы исследований 1. Биологическая роль митохондрий 2. Ультраструктура митохондрий 1. Общие принципы организации 2. Особенности строения мембраны митохондрий 3. Описание общих принципов различных методов выделения митохондрий 1. Гомогенизация материала 1. Механическая 2. На основе кавитации газов 3. Ультразвук 2. Разделение субклеточных компонентов 1. Центрифугирование 2. Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера 3. Электрофорез 4. Ферменты - маркеры митохондрий 4. Методики 5. Заключение 6. Список литературы Введение История вопроса. Кёлликер одним из первых описал характерным образом ориентированныегранулы в саркоплазме поперечно-полосатой мышцы. Ему принадлежит так жечесть первого выделения митохондрий из клеточных структур. В 1888 году онвыделил эти гранулы из мышцы насекомых и показал, что они обладаютмембраной и набухают в воде. Началом новой эры в цитологическом изучениимитохондрий явилась работа Бенсли и Хэрра, которые предприняли попыткувыделить митохондрий из взвеси разрушенных клеток печени, применив методдифференциального центрифугирования. Из-за отсутствия подходящей среды длясуспендирования и несовершенства метода центрифугирования Бенсли не удалосьполучить интактные митохондрий, но именно новаторская работа Бенслиопределила слияние цитологических исследований митохондрий с исследованиямидыхания. Перспективы исследований. В настоящее время основная задача изучения митохондрий на молекулярномуровне сводится к выделению ферментативных компонентов окислительныхциклов, определения их молекулярной структуры и механизма действия, анализуих участия в полиферментных системах в митохондриях и картированию ихлокализации на структурах митохондрий. То обстоятельство, что ферментыдыхательной цепи составляют более 25 % белка митохондриальных мембранзаставляют рассматривать эти ферменты не только как функциональные, но икак структурные элементы митохондрии. Биологическая роль митохондрий. На протяжении ста с лишним лет, т. е. со времени первых работ Кёлликера(1850), наблюдавшего гранулы в саркоплазме поперечнополосатых мышц, велиськропотливые морфологические исследования, которые постепенно подготавливалипочву для всестороннего изучения природы митохондрий. Но только в 1949 г.Кеннеди и Ленинджер установили, что в митохондриях протекает циклокислительного фосфорилирования, т.е. что митохондрий служат местомгенерирования энергии. С этого момента начинается новая эра в изучениимитохондрий — эра, в которой блистательные открытия следуют одно за другим.В короткий срок были открыты осмотическая, сократительная, регуляторная игенетическая функции митохондрий и найдены многие из тех молекулярныхструктур, которые служат первичным субстратом 'этих функций. Было показанотакже, что митохондрий обеспечивают интеграцию многочисленных процессовклеточного обмена. Эти исследования еще не, завершены, но они могут служитьпримером плодотворности нового подхода к изучению живого, того подхода,который отличает молекулярную биологию. В развитии молекулярной биологии за последнее время наметился новыйэтап. До сих пор это были исследования главным образом, на уровнеоднородных молекул белков и нуклеиновых кислот, исследования, посвященныеих структуре, функции и биосинтезу. Теперь же исследователь недовольствуется этим и переходит к изучению специфически организованныхнадмолекулярных комплексов, каковыми являются клеточные органеллы.Некоторые функции этих органелл также могут быть истолкованы на уровнеиндивидуальных молекул, например молекул отдельных ферментов. Но главнаяособенность клеточных органелл — это интеграция ферментативных процессов.Так, благодаря наличию в составе митохондрий различных белков, липидов,нуклеиновых кислот и углеводов, соединению их между собой и упорядоченномуразмещению в пространстве в виде трехслойных мембран эти образованияприобретают свойства, которые исчезают при их расчленении на отдельныемолекулы. Свойства эти: векторный характер действия митохондриальныхферментов (в отличие от скалярного, т. е. не зависящего от направления,действия растворимых ферментов), способность к непосредственномупреобразованию энергии окисления в осмотическую и механическую энергию,способность к автономному синтезу белков и т. д. Каждое из этих свойствопределяется не простой суммой реакций, катализируемых отдельнымиферментами, а обусловлено взаимодействием точно ориентированных ферментныхи неферментных макромолекул. Само собой разумеется, что глубокоеисследование и познание природы клеточных органелл возможно лишь путемрасчленения их на отдельные молекулы с последующей реконструкцией. Ультраструктура митохондрии Общие принципы организации. Внутренне пространство митохондрии окружено двумя непрерывнымисистемами мембран, каждая из которых представляет собой замкнутый мешок;эти мешки расположены так, что всю митохондрию можно представить себе, какмешок внутри мешка. Просвет внутреннего мешка не сообщается с пространствоммежду двумя мембранами. Наружная мембрана гладкая, а внутренняя образуетмногочисленные впячивания, которые в самом простом случае имеют формуперегородок, но могут принимать крайне сложные очертания. Палад назвал этивпячивания митохондриальными кристами. Другой характерный компонентструктуры митохондрии - это матрикс, который заполняет просвет, окруженныйвнутренней мембраной. Известно, что он содержит много белка и некотороеколичество липидов; по-видимому, он обладает определенной организацией иболее или менее жесткой структурой. Наконец, митохондрии, фиксированныеосмием часто содержат в матриксе ряд мелких гранул. Число, диаметр иплотность этих внутримитохондриальных гранул изменяются в зависимости отсостояния обмена веществ в тканях. Особенности строения мембраны митохондрии. Так как наибольшее практическое значение представляют внутренниемембраны митохондрии, содержащие дыхательные ансамбли, имеет смысл болеедетально познакомиться с ультраструктурой митохондриальной мембраны. Придетальном анализе было выявлено, что митохондриальные мембраны содержат 35-40 % липидов, преимущественно фосфатидов, и 60 - 65 % белка. Небольшиеразличия, которые иногда наблюдаются обусловлены различными условиямиполучения при использовании различных физических и химических способовразрушения структуры митохондрии. Митохондрии печени крысы содержат значительные количествафосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, инозитфосфатидов, кардиолипина ифосфатидилсерина; содержание плазмалогена и сфингомиелина невелико, иногдаони вовсе отсутствуют. Характерное содержание и количественное содержаниелипидов в митохондриальной мембране, вероятно обусловлены необходимостьюподдержания термодинамически устойчивого двойного слоя липидов, образующегоостов мембраны, который служит опорой для дыхательных ансамблей. По-видимому, большое значение имеет тот факт, что практически все липидымитохондриальной мембраны экстрагируются смесью хлороформ - метанол. Этоуказывает на наличие лишь незначительного числа ковалентных связей междулипидами и белковыми элементами или даже на полное их отсутствие; этот фактсвидетельствует о высокой степени стабилизации липидов и белков мембранныхструктурах. Крейн показал, что цитохром с соединяется сфосфатидилэтаноламином, образуя устойчивый комплекс. Возможно, что именнотакое взаимодействие липид - белок совместно с гидрофобными связями иобеспечивает такую стабилизацию мембранной структуры. Криддл и сотрудникивыделили мономерную форму, которую они назвали структурным белкоммитохондриальной мембраны. При нейтральном рН структурный белок находится вполимерной форме и не растворим в воде. Мономерная форма имеет молекулярныйвес около 22000, но тенденция к полимеризации нарушает точностьседиментационных и электрофоретических исследований. Структурный белокспособен соединяться с чистыми цитохромами а, Ь, и ее образованиемрастворимых в воде комплексов в молярном отношении 1:1, причем условияэтого взаимодействия для каждого случая различны. Предполагается, что втаких комплексах образуются преимущественно гидрофобные связи. Далее,оказалось, что структурный белок соединяется с фосфолипидами. Такимобразом, структурный белок способен к взаимодействию с двумя другимиосновными молекулярными элементами мембраны - с переносчиками электронов ис фосфолипидами. Склонность цитохромов, флавопротеидов и структурного белкак существованию в мономерной и полимерной формах указывает на выраженнуютенденцию этих молекул к образованию оченьустойчивых макромолекулярных ансамблей, имеющих пластинчатую структуру. Так как для будущих исследований наибольший интерес представляетцитохром с, то следует уделить особое внимание именно этому ферменту. Этот цитохром отличается от остальных тем, что он легко экстрагируетсяиз митохондрий в растворимой форме с помощью кислот и нейтральных растворовсолей. Молекулярный вес кристаллического фермента 12000, изоэлектрическаяточка при высоком рН; в молекулу входит одна железопорфириновая группа,которая представлена производным протопорфирина и соединена (ковалентно) сдвумя цистеиновыми остатками пептидной цепи, посредством двух тиоэфирныхсвязей. При рН 7,0 атомы железа в положениях 5 и 6, очевидно, координированы состатками гистидина; при нейтральных значениях рН цитохром с не имееттенденции реагировать с кислородом. Известно, чтотретичная структура цитохрома с резко изменяется, как функция состоянияокисления - восстановления. Цитохром с восстанавливается тиолами, аскорбатом, хинолами, ивосстановленными цитохромами b и с1, а восстановленный цитохром сокисляется феррицианидом, некоторыми красителями и цитохромом а. Было показано, что в водных растворах цитохром с способен кполимеризации; удалось получить его димер и очистить так же тример итетрамер. Вторичная и третичная структура цитохрома с изучается методомрентгеноструктурного анализа. Цитохром с легко соединяется с липидами, вчастности с фосфатидилэтаноламином он образует комплекс, названныйлипоцитохромом с. Описание общих принципов различных методов выделения митохондрий. Митохондрии и после выделения сохраняют свой вид, не смотря на то, чтомембраны их несколько повреждаются и контуры сглаживаются. В сущности, внаше время их выделяют тем же самым способом, которым пользовался ещеВарбург. Прежде всего ткани гомогенизируют, используя для этогоизотонический или гипертонический раствор сахарозы (сахароза способствуетсохранности митохондрий, стабилизируя митохондриальную мембрану). Затемметодом дифференциального центрифугирования отделяют ядра и неразрушенныеклетки, а полученную надосадочную жидкость вновь центрифугируют при болеевысоких скоростях. Митохондрий оседают при этом на дно, образуя плотныйбуроватый осадок. Промыв этот осадок несколько раз можно получить довольночистую митохондриальную фракцию. Таким путем очищенные фракции митохондрийбыли выделены из самых различных клеток животного и растительногопроисхождения и даже из некоторых простейших. В более ранних исследованиях митохондрий, как правило, получали изпечени животных, так как её клетки очень легко разрушить, а так же потому,что она богата митохондриальной фракцией. После того, как было обнаружено,что бактериальная протеиназа разрушает клетку, не повреждая митохондрий,был разработан простой и быстрый метод получения мышечных митохондрий.Сахароза способствует сохранности митохондрий, стабилизируямитохондриальную мембрану. Гомогенизация материала. Методы гомогенизации: • Разрушение клеток(гомогенизатор Даунса 5-12 мл + плотно прилегающий пестик). Гипотоническийшок + гомогенизатор. • Метод основанный на кавитации газов( клеточная суспензия обогащенная газообразным азотом на 15-30 минутвыдерживается при давлении до 65 атм., при быстром понижении давления доатмосферного, вследствие выделения азота происходит разрушение клеток.Органеллы остаются интактными). • Ультразвук.Состав среды в которой разрушают клетки определяется применяемым методомгомогенизации. Для разрушения тканей используют изоосмотический растворсахарозы из расчета 100 мл на 10 г сырого веса ткани, при этом нестрашноесли раствора сахарозы будет немного больше, особенно при центрифугированиив роторе с большим объемом. Гипотоническая среда способствует разрушениюклеток, но, если обработка длится слишком долго, при этом может происходитьразрушение клеточных органелл. Остальные параметры среды трудно обобщить икаждый мембранный препарат требует индивидуального подхода. Разделение субклеточных компонентов. • Центрифугирование.Основан на различиях по скорости седиментации (определяется весом, размероми формой частиц). Вещество, используемое для приготовления градиента должнобыть легко растворимо в воде, физиологически безвредно и химически инертно;его раствор должен быть невязким, прозрачным в видимой и УФ-областяхспектра, должен создавать низкое осмотическое давление. Обычно разделениесубклеточных компонентов проводят в градиенте плотности сахарозы. Онудовлетворяет большинству указанных требований, но при высокихконцентрациях он весьма вязок. Как правило разделение осуществляется за 3-4часа или в течение ночи при 80.000 д или выше в роторе с подвеснымистаканчиками. Обработка гомогената из печени крысы 10 мМ фосфатом калия увеличиваетскорость седиментации митохондрий, не влияя на осаждение лизосом, чтопозволяет очищать последние в градиенте плотности перколла. • Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера.Полезным и быстрым способом выделения мембран является разделение их вводной двухфазной системе декстран - полиэтиленгликоль (ПЭГ), особенно еслиотсутствуют необходимые ультрацентрифуги и роторы. Метод, продуктивностькоторого может быть легко повышена, основан на использовании целого рядасвойств мембран, включая электрический заряд, плотность, массу игидрофобность. Различие в этих свойствах обуславливает разное распределениекомпонентов смеси между верхней и нижней фазами и поверхностью раздела. Посродству к верхней фазе компоненты животной клетки располагаются вследующем порядке: эндоплазматический ретикулум / митохондрий / лизосомы /аппарат Гольджи / плазматические мембраны Успех в применении фазовых системзависит от адекватности выбора их состава. Качество разделения зависит нетолько от конкретного полимера (пока число их ограничено - в основномиспользуют декстран и ПЭГ), но и от других параметров: молекулярной массыполимера, концентрации солей, рН, химической модификации полимера. • Электрофорез.С помощью высоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получитьпрепараты субклеточных мембран и органелл высокой степени чистоты.Подлежащую разделению смесь компонентов подают тонкой струйкой вразделяющий буфер, который движется в электрическом поле; мембраны, несущиеразный электрический заряд перемещаются в разделяющей ячейке со скоростью,определяемой их зарядом, при этом достигается 100 %-ное разрешение. Этомягкий способ выделения мембран с высоким препаративным выходом. Методикуэлектрофореза в свободном потоке впервые применили для выделения лизосом имитохондрий из печени крысы. Таблица 1. Ферменты - маркеры митохондрий|Фракция | |Маркерный фермент ||Митохондрии |Внутренняя |Сукцинатдегидрагеназа, Цитохромкидаза, || |мембрана |Ротеном-нечувствительная NADH – цитохром с || | |– редуктаза ||Митохондрии |Наружная |Моноаминооксидаза, Кинуренин-3-гидроксилаза|| |мембрана | | В таблице 1 приведены ферментные маркеры, к которым относятсясравнительно стабильные ферменты, активность которых достаточно высока и ееудобно измерять. Обычно эти измерения проводят как можно быстрее послевыделения; образец при этом хранят при 40С и не замораживают. Отмечено, чтотакой фермент, как цитохром с - редуктаза может оказаться лабильным итерять активность в замороженных препаратах мембран из печени. Дляправильной оценки распределения фермента-маркера весьма существеннымявляется пространственное расположение субстрат-связывающего сайта. Методики Субфракционирование мембран и компонентов матрикса митохондрий. Митохондрии выделяют из многочисленных источников стандартнымиметодами. Субфракционирование их для получения внутренних и наружныхмембран и компонентов матрикса проводят после замораживания - оттаиванияпрепарата и / или обработки ультразвуком стандартного осадка митохондрий,суспендированных в среде, содержащей 1.2 М сахарозы и 2 мМ АТР (10 мгмембранного белка на 1 мл). При этом происходит разрушение митохондрий, апосле центрифугирования в ступенчатом градиенте плотность сахарозы наружныемембраны концентрируются в полосе 0,45-1,12 М сахарозы, внутренние мембраныи компоненты матрикса собираются в осадке, под нижним слоем с концентрациейсахарозы 1,2 М, а промежуточная везикулярная фракция - между двумяпредыдущими, в полосе 1,12-1,20М. Маркерами внутренних митохондриальных мембран служат ферменты -переносчики электронов. Наружная митохондриальная мембрана, которая прифрагментации образует везикулы, сходные по плотности и морфологии свезикулами из плазматической мембраны содержит моноаминооксидазу. Описантакже метод выделения наружных митохондриальных мембран из печени крыс. Метод противоточного распределения митохондрий. Препараты митохондрий, выделенные из печени крысы, были исследованыЭрикссоном с помощью метода противоточного распределения. Митохондрий,входящие в состав каждого из этих препаратов, можно разделить на двеосновные популяции. Однако элетронно-микроскопическое исследование непозволило обнаружить никаких различий в структуре этих частиц. Рабочая методика выделения митохондрий из печени крыс. • Среда выделения: 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 0,001 М ЭДТА,рН 7,4 • Сахароза - 0,25 М раствор • НС1 - 1 н и 0,1 н растворы • КОН - 1 н и 0,1 н растворы Все реактивы готовятся на бидистиллированной воде. Изолированную печень крысы погружают в 30 мл ледяной среды выделения.После 2х - Зх кратного промывания ткань измельчают ножницами на чашкеПетри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средойвыделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно,жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Тканьпереносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают втечение 30 - 40 секунд. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения,перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в 2 центрифужныхстакана. Центрифугируют в течение 10 минут при 0-2 ОС, при 600 д дляудаления обломков клеток и ядерной фракции. Супернатант осторожно сливают и хранят на льду, остатки объединяют ивновь гомогенизируют 20 секунд в 20 мл среды выделения. Гомогенатцентрифугируют при 600 д 10 минут, супернатант объединяют с полученнымранее. Для осаждения митохондрии, объединенный супернатант центрифугируют вдвух стаканах при 14000 g в течение 10 минут. Остатки объединяют в одномстакане и тщательно суспендируют с помощью пипетки на 1 мл в небольшомобъеме среды выделения (около 0,5 мл). .Маленькими порциями, при осторожномвстряхивании добавляют 10 мл среды выделения и осаждают митохондрии (14000g, 10 минут). Осадок суспендируют в 0,25 М сахарозе, не содержащей ЭДТА, ивновь центрифугируют (14000 g, 10 минут). Супернатант сливают, наполученный осадок митохондрии осторожно наслаивают 0,2 - 0,3 мл 0,25 Мсахарозы. Легким встряхиванием смывают верхний рыхлый слой осадка.Процедуру повторяют еще дважды и полученный плотный осадок митохондриитщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарозы.Густую суспензию митохондрии переносят в пробирку и хранят на льду. Заключение В данной работе предложены различные методики выделения митохондрии изпечени крыс, но использоваться будет метод с применениемультрацентрифугирования, как наиболее приемлемый и удовлетворяющийкритериям простоты работы и необходимой степени чистоты продукта. В дальнейшем планируется фотометрическое изучение влияния этидиумбромида на активность цитохрома с из митохондрии печени крыс. Данная работапредставляет практический интерес, так как цитохром с является индукторомапоптоза - программированной гибели клеток. Механизмы этого процесса внастоящее время представляют большой интерес (для лечения онкологическихзаболеваний). Список литературы1. Альбертсон Пер-Оке "Разделение клеточных частиц и макромолекул", Москва, 19742. Боуэн Т. "Введение в ультрацентрифугирование", Москва, 19733. Под ред. Гилярова М.С. "Биология. Большой энциклопедический словарь", Москва, 19984. Ленинджер А. "Митохонрия" Москва "Мир", 19665. Решетников В.Н. и др. "Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров" т.2, Минск, 19776. Эванз У. Г. "Биологические мембраны. Методы", Москва, 1990




Нажми чтобы узнать.

Похожие:

Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconВлияние янтаря-антитокса и силимарина на окислительное фосфорилирование и перекисное окисление липидов в печени крыс при экспериментальном сахарном диабете
Влияние янтаря-антитокса и силимарина на окислительное фосфорилирование и перекисное окисление липидов в печени крыс
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconТема «Белки. Нуклеиновые кислоты»
Аминокислоты, определение, биологическая роль, классификация, структура аминокислот, механизм образования пептидной связи, структура...
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconДокументи
1. /выделение митохондрий.doc
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс icon03. 01. 04 – биохимия автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2011
Углевод-белковые комплексы печени и сыворотки крови у пренатально алкоголизированных крыс
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconРоль опиоидных пептидов в регуляции желчеотделения при интактной и изолированной печени
Выявлено, что эффекты опиоидных пептидов, наблюдающиеся на изолированной печени, могут маскироваться более высокими уровнями иерархической...
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconМорфофункциональное состояние печени при введении нагруженных сфингомиелином или церамидом липосом на фоне токсического гепатита у крыс
Показано, что наиболее выраженное торможение воспалительной реакции наблюдается при введении липосом, содержащих сфингомиелин
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconТезисы докладов V сибирского физиологического съезда Abstracts of the V siberian Physiologic Congress
Крыс (по 12 в группе) декапитировали через 3, 7 и 24 ч после кровопотери. В ткани печени определяли концентрацию малонового диальдегида...
Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconБиологическая роль железа

Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconБиологическая роль каротиноидов

Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс iconБиологическая роль гидролиза в процессах жизнедеятельности организма

Разместите кнопку на своём сайте:
Документы


База данных защищена авторским правом ©rushkolnik.ru 2000-2015
При копировании материала обязательно указание активной ссылки открытой для индексации.
обратиться к администрации
Документы